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    骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)

    點(diǎn)擊次數(shù):1890  更新時(shí)間:2015-11-18

        骨髓作為主要的造血場(chǎng)所,可進(jìn)行體外培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下,把骨髓細(xì)胞分離出來,置于培養(yǎng)系統(tǒng)中,在合適的環(huán)境中,提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使其繼續(xù)生存或生長(zhǎng)。通過培養(yǎng)骨髓,可見到造血干細(xì)胞不同分化階段時(shí)各種血細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞。用通常的形態(tài)學(xué)方法不可能識(shí)別造血干細(xì)胞和各種血細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞,但在加入各種造血因子的半固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后,可出現(xiàn)單個(gè)前驅(qū)血細(xì)胞的增殖、分化,并形成細(xì)胞克隆。

    一、材料

    1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠(C57BL/6\B6D2Fl等)2只。

    2.培養(yǎng)液瓊脂(Difco)、a—MEM、FBS(用新生牛血清、人血清也可)。

    3.器具吸管、試管、注射器、25ml培養(yǎng)瓶、35mm塑料培養(yǎng)皿、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、解利用具、倒置顯微鏡、解剖顯微鏡。

    4.試劑Turk液(白細(xì)胞稀釋液)。

    二、方法

    1.軟瓊脂培養(yǎng)液的制備將瓊脂30mg置于一試管中,加蒸餾水3ml,103.4kPa高壓滅菌,待冷卻至50℃~60℃時(shí)加2倍濃度的a-MEM等量混合,置于42℃水浴中保溫。

    2.取材小鼠經(jīng)麻醉處死,全身浸泡于75%乙醇中消毒5min,拎出后將小鼠仰面翻鋪于超凈臺(tái)上一個(gè)消毒托盤上。用眼科鑷小心捏起小鼠兩髖關(guān)節(jié)之間的腹部皮膚,用眼科剪小心剪開皮膚,并分離兩下肢的皮膚,往下在腳踝處剪斷,往上在髖關(guān)節(jié)處剪斷,這樣可以游離出小鼠的兩條下肢。將它們放入另外一個(gè)消毒托盤中,并換一套新的剪子和鑷子。手術(shù)器械事先均必須消毒。

    3.骨髓細(xì)胞的制備剝離肌肉,切除兩側(cè)股股,去除周圍肌肉組織后放人35mm塑料培養(yǎng)皿中,切除兩側(cè)骨的端部,用吸有a—MEM培養(yǎng)液的注射器沖壓出骨髓于一短試管中,霜10ml吸管吹打骨髓團(tuán)塊后放置10min,將懸浮的細(xì)胞移植到另一試管中。取細(xì)胞懸液0.1ml與Turk液O.9ml混合,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù),用a—MEM將骨髓細(xì)胞濃度稀釋成5×105/ml。

    4.細(xì)胞接種取骨髓細(xì)胞懸液0.5ml、條件培養(yǎng)液O.5ml及FBS lml,混合于無(wú)菌試管中:加42℃軟瓊脂培養(yǎng)液3ml,迅速混合后移至35mm塑料培養(yǎng)皿中,使整個(gè)平皿底部鋪平(注意:此操作的動(dòng)作要快,溫度不能太低,瓊脂不能在未分裝前就凝固于試管中)。靜置10min后瓊脂板可*凝固,置37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)7d。

    5.顯微鏡觀察與克隆計(jì)數(shù)低倍率(40~100倍)的倒置顯微鏡或解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù),含有50個(gè)以上的細(xì)胞計(jì)數(shù)一個(gè)克隆,正常骨髓的發(fā)生率為100~200個(gè)/105個(gè)骨髓細(xì)胞。

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