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    感覺態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)步驟

    點(diǎn)擊次數(shù):2065  更新時(shí)間:2020-04-27
       感覺態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn):
      1.限制缺陷型:外切酶和內(nèi)切酶活性缺失,外源基因進(jìn)入后可穩(wěn)定存在。
     
      2.感染缺陷型:防止重組細(xì)胞擴(kuò)散污染。
     
      3.重組整合缺陷型:外源基因進(jìn)入后游離在染色體外,不會(huì)發(fā)生重組。
     
      4.高轉(zhuǎn)化率:易接受外源核酸。
     
      5.遺傳互補(bǔ):與載體有選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型,能夠篩選。
     
      感覺態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟:
      (1)感受態(tài)細(xì)胞的制備
      1)挑取大腸桿菌劃線于LB平板上,在37℃恒溫培養(yǎng)過夜(16-18h)。
     
      2)挑取單菌落于50mLLB培養(yǎng)基中37℃、200r/min培養(yǎng)3-4h,至出現(xiàn)薄霧狀菌懸液即可。
     
      3)將培養(yǎng)液置于冰上預(yù)冷15min,并間斷輕輕搖動(dòng)。
     
      4)將冷卻的培養(yǎng)液倒入己在冰上預(yù)冷的50mL離心管中。
     
      5)在冷凍離心機(jī)中離心,4℃3000r/min離心5min。
     
      6)棄上清、加入15mL冰上預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液,輕輕旋轉(zhuǎn),使細(xì)胞充分重新懸浮,冰上放置20-30min。
     
      7)于4℃3000r/min離心5min。
     
      8)棄上清,加入2mL冰上預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液,輕輕旋轉(zhuǎn),使細(xì)胞充分重新懸浮,5min后就可以用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),或添加保護(hù)劑,低溫或超低溫冷凍貯藏備用。
     
     ?。?)感覺態(tài)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)化
      1)將-80℃保存的細(xì)胞置于冰中融化10分鐘。
     
      2)取細(xì)胞移至新的轉(zhuǎn)化管中。向細(xì)胞中加入0.1ng~10ng(3µl~10µl)的轉(zhuǎn)化用DNA,輕輕混勻后冰中放置30分鐘。
     
      3)42℃水浴中放置45秒鐘后,立即于冰中放置1~2分鐘。
     
      4)加入890µl37℃預(yù)溫的SOC培養(yǎng)基,在37℃200r/min振蕩培養(yǎng)50-60min,使細(xì)菌復(fù)蘇,抗性得以表達(dá)。
     
      5)取100μL左右轉(zhuǎn)化液涂布在含有4μLIPTG,40μLx-ga1和氨芐青霉素(Amp50μg/mL)的平板上。
     
      6)倒置平板于37℃培養(yǎng)16-18h,觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄。
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